不同引物對消除非目標DNA效率的影響

2017-01-19    編輯:諾禾致源
SNP概念

植物中包含真核細胞、原核細胞、以及葉綠體、線粒體等細胞器。不同的植物中,線粒體和葉綠體的數量也不盡相同。葉綠體DNA、線粒體DNA和細菌16S rDNA之間的序列同源性對于尋找合適的引物來研究植物內生微生物帶來了挑戰。


對于避免細胞器的污染,有三種可行的辦法:
      1、改良現有的DNA提取方法,使之盡可能少的提取出細胞器DNA;
      2、研發一種阻斷技術,阻止/降低真核宿主基因序列的擴增;
      3、利用特定的引物,擴增細菌16S rDNA同時又避免葉綠體DNA的擴增,其中,第三種方法最為常用。

下面以2016年發表在《Frontiersin Microbiology》(IF 4.165)文章“利用不同的引物研究楊樹根系和根內微生物多樣性”為例進行詳細的闡述。


內容簡介

245棋牌 本文選擇了7對不同序列的引物,分別以楊樹根際土壤、根、莖和葉的基因組序列為模版進行擴增,比較不同的引物擴增下葉綠體和線粒體的污染情況及微生物組成情況,為尋找避免葉綠體和線粒體的污染提供理論依據。本研究為植物微生物避免葉綠體的污染及開發適合新平臺引物提供了理論依據。

研究結果

利用不同的引物研究楊樹根際土壤微生物,一些引物能有效降低檢測到的葉綠體DNA的含量(967F-1391R:<0.1%,341F-785R:0.1%,341F-783Rabc:<0.1%)和線粒體(799F-1193R<0.1%)。檢測到線粒體、質粒或許與植物組織的腐爛、組織內含有真核微生物有關。

利用不同的引物研究楊樹組織中的微生物,不同的引物所呈現的結果差別甚大。特定的引物能有效降低葉綠體DNA的污染,例如:引物799F-1391R和799F-1193R能完全消除莖、葉內葉綠體的污染,341F-783Rabc不能有效的避免葉綠體的污染。

楊樹葉片的葉綠體DNA,利用不同的引物進行qPCR擴增。799F-1391R和799F-1193R對葉綠體DNA親和力較低,分別為9.2%和17.4%。其他測序引物對葉綠體DNA的親和力較高(圖1)。

圖1 不同引物葉綠體DNA擴增效率比較



245棋牌 選擇與葉綠體DNA低親和的三對引物(799F-1391R、799F-1193R、341F-783Rabc)的測序結果進行注釋及比較分析,在根際土壤中,三對引物得到的平均OTUs數目分別為277、236、270。在根部,799F-1391R所得OTU數目最多,達115。799F-1193R和341F-783Rabc分別得到79和87個OTU(圖2)。


說明:在門水平上,根際土壤中,三對引物鑒定到的主要菌群是變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門;根內主要菌群是變形菌門、擬桿菌門;在莖內,引物341F-783Rabc得到的變形菌門遠遠高于其他兩對引物,這顯然與前者測序得到的數據量少有關;葉片中,變形菌門占優勢(圖3、4)。

圖2 不同引物序列測序注釋結果覆蓋度
(左上)799F-1391R (右上) 799F-1193R (下) 341F-783Rabc

圖3 不同引物序列測序注釋結果α多樣性分析
從上到下依次對應土壤、根、莖、葉,均一化reads數為417,
245棋牌 nd為由于序列數目太少而不確定的結果

圖4 不同引物擴增的植物不同部位門水平上相對豐度柱形圖
從左上到右下依次為根際土壤、根、莖、葉,變形菌門分類到了四個
245棋牌 亞型(alpha,beta,gamma,delta)



在門水平上,根際土壤中,三對引物鑒定到的主要菌群是變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門;根內主要菌群是變形菌門、擬桿菌門;在莖內,引物341F-783Rabc得到的變形菌門遠遠高于其他兩對引物,這顯然與前者測序得到的數據量少有關;葉片中,變形菌門占優勢。


研究結論

不同的引物對于消除非目標DNA具有不同的效率,本研究選用的7對引物中,799F-1391R、799F-1193R能有效消除葉綠體的污染,且α多樣性相對較高,物種豐度最大,適用于根際和內生菌的研究。其原理是利用在引物設計時,799F這一正向引物,只能特定的識別細菌的16Sr DNA序列,而與葉綠體DNA不能匹配,從而有效避免葉綠體DNA的污染。


延伸

現在使用最為廣范的平臺Illumina HiSeq和MiSeq讀長的限制,799F-1391R這對引物似乎并不適用,799F-1193R這對引物,盡管α多樣性略低于799F-1391R,但這與本文數據量不夠有關,或許更高深度的測序能有效解決這一問題,更好的還原植物內生微生物的菌群結構。

參考文獻

245棋牌 Beckers B., Beeck M. O. D., Thijs S., et al. Performance of 16s rDNA Primer Pairs in the Study of Rhizosphere and Endosphere Bacterial Microbiomes in Metabarcoding Studies. Frontiers in Microbiology,2016.