全基因組擴增技術

2017-03-10    編輯:諾禾致源

有研究表明,每個細胞都是獨一無二的,即使來源相同的單個細胞,
由于隨機生物過程和環境擾動的原因,
彼此在許多方面也存在差異。二代測序技術是為細胞群體設計的,
所需要的樣品量為mg級,而單細胞中的DNA(大約只有6 pg DNA)是無法滿足測序的樣品量,
所以無法滿足科研工作者對單細胞研究的需求。
為了使少量樣品滿足測序的要求,全基因組擴增技術(WGA)橫空出世。

WGA技術

技術原理

245棋牌1. DOP-PCR擴增

DOP-PCR擴增(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR):使用簡并配對引物,即類脫氧肌苷引物,它可以結合到DNA任何部位。引物的3’端為6bp退化寡核苷酸,5’端為正常的堿基。3’端和DNA鏈隨機結合,最初幾個循環退火溫度要低(30℃左右),然后延伸直到5’端引物配對處。特點是擴增均一性差和片段長度不定(圖1)。

2. MDA擴增

MDA擴增(Multiple Displancement Amplification):使用多種引物六聚體和φ29DNA聚合酶。引物六聚體是由6個隨機核苷酸組成的;而φ29DNA聚合酶是一種高保真聚合酶,具有3‘到5’外切酶校讀能力,并且具有特殊的多重置換和連續合成特性。特點是擴增長度50-100bp,指數擴增,存在擴增偏倚性(圖2)。

3. MALBAC技術

MALBAC技術(multiple annealing and looping-based amplification cycles):利用φ29聚合酶的前鏈移開功能,以原始基因組為模版進行復制,其擴增產物具有完整的末端,因此可以發生環化,不被復制,保證了線性擴增以降低擴增偏倚性,同時有較高的擴增效率(圖3)。

擴增效果

標紅的為LWGS效果較好的組,在這四組中進行比較得知:
1、檢測覆蓋度,MDA和MALBAC效果優于DOP。
2、在靈敏度方面:四種試劑WGS,發現MDA-2和MALBAC效果較好,MDA基因組回收靈敏度最高。
3、檢測SNV和CNV, MDA-2和MALBAC檢測率和準確性高,MDA存在擴增偏好性,MALBAC 擴增偏好性低,均一性,覆蓋度比MDA高,
245棋牌但MDA-2成本相對較低。

參考文獻

[1] Hou Y, Wu K, Shi X, Comparison of variations detection between whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing. Gigaxcience. 2015, 4:37.
[2] Huang L, Ma F, Chapman A. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology an Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015, 16:79-102.