環狀RNA驗證

2017-03-10    編輯:諾禾致源

環狀RNA(circRNA)是一類具有閉合環狀結構的非編碼RNA,
其閉環結構可以逃逸RNA酶的降解,因此比線性RNA更穩定。
已有的研究表明,circRNA在腦發育神經細胞分化、精神疾病(如阿爾茨海默癥)、
腫瘤發生與發展中均發揮重要作用。
作為非編碼RNA新寵,人們對其一探究竟的熱情持續高漲,
利用高效的二代測序手段可快速獲得circRNA種類、表達豐度、生物學功能等信息。
circRNA到底發揮哪些作用?想要得到結論,還要回到傳統實驗中進行驗證。

一、circRNA序列及定量驗證

1.1 circRNA定量驗證

驗證方法通常采用qPCR法。但是circRNA引物設計相比線性RNA比較麻煩。

1.2 結論

circRNA鑒定時,根據測序reads同時比對到外顯子B和D的情況,推測該基因可能發生環化;同時,根據junction位點堿基特點對發生環化的外顯子向兩側延伸,確認其符合兩側分別是GT/AG的特點(當然,GT、AG并不在circRNA序列中),判斷該基因產生的為circRNA。拿到鑒定好的circRNA序列之后,秉承擴增產物越短越好并跨越junction 位點的原則(增強back splice site擴增效率),設計divergent primers,擴增產物為圖2上方黃色片段。

2.1 Northern blot驗證circRNA序列

245棋牌Northern blot方法是驗證RNA序列既傳統又高效的方法,需要注意的是探針的設計是事關雜交實驗成敗的關鍵因素,對于exon環化circRNA,設計的探針要求跨越back splice junction位點;對于含內含子環化circRNA,除了跨backsplice junction 位點設計 探針外,還可在內含子區域設計探針。

2.2 驗證實驗

A、對total RNA去DNA、去rRNA、去線性RNA(RNAse R/H消化)處理,與探針雜交;
B、Total RNA與探針雜交;
C、基因組DNA與探針雜交
245棋牌以上A、B、C同時進行,共同驗證。

3. circRNA是否存在?

通過電泳實驗可以實現,提取total RNA分成兩份,一份同時去rRNA去線性RNA,一份不做處理,分別進行電泳,對比兩者可發現前者還可以看到電泳條帶。另外,circRNA要比同等長度的線性RNA跑的慢,所以根據二代測序鑒定出的circRNA長度觀察電泳結果,如果條帶落后于相應marker,也可以初步判斷目標circRNA的存在。

245棋牌二、circRNA功能驗證

1.1 circRNA研究較晚,目前發現的主要功能

A. 發揮海綿效應(sponge)吸附miRNA。
B. 與RNA結合蛋白(RBP)結合,形成復合物,調控RNA的轉錄。
245棋牌另外,circRNA表達具有很強的組織特異性和保守性。


1.2 驗證實驗

(1) 驗證circRNA表達的組織特異性
245棋牌原位雜交(Situ Hybridization)設計雜交探針,探針同樣要跨back splice site,可以很清楚的看到circRNA在哪些組織中表達很高,作為組織特性判斷的依據(圖3)。


(2) 過表達——正向驗證
circRNA在體外不能成環,circRNA過表達的原理主要是基于circRNA的成環機理。circRNA的成環基于circRNA側翼序列的堿基互補配對(互補序稱為Alu結構)。基于circRNA側翼Alu序列特征,PCR擴增含側翼Alu序列的目標DNA序列(注意擴增的模板就是DNA),隨后依據對應限制性內切酶位點進行酶切,進而連接載體,轉染進對應細胞樣本。設計引物擴增產物后進行片段回收,通過sanger測序驗證轉染效率,或構建共表達載體(帶GFP標簽)通過熒光判斷轉染效率,最后利用divergent primer驗證circRNA過表達情況。
245棋牌過表達建議:擴增包含circRNA側翼Alu序列或內部堿基互補序列的目標區域。有研究表明側翼上下游1kb處過表達效果更明顯。


(3)基因沉默——反向驗證
通過siRNA干擾封閉circRNA的功能(圖4)。針對外顯子環化circRNA,可在back splice junction位點前后設計siRNA;針對內含子環化circRNA,除了back splice junction位點前后序列設計siRNA以外,也可針對內含子序列設計siRNA;每個siRNA設計對應對照,對照siRNA設計要求:back splice junction 位點一端互補配對,另一端錯配(陰性對照)。


參考文獻

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