生態樣本制備及DNA提取方法

2017-03-05    編輯:諾禾致源

常見生態樣本一覽表

PacBio三代測序的優勢

· 取樣方法

根據研究目的確定采樣范圍,取樣器具要事先消毒滅菌處理。采樣時應去除表面浮土,使用乙醇火燒的鏟子挖取地下5~20cm的土層,去除可見雜質后,土壤過2mm篩網。每個樣品從3個或以上采樣點采集并混合,去除雜質后,每5~10g分為一份,保存于無菌離心管中,置于0℃以下運回實驗室,用于抽提DNA。如不能馬上實驗,置于-80℃保存。

· 提取方法

手工提取參考文獻:Clegg C D, Ritz K, Griffiths B S. Direct extraction of microbial community DNA fromhumified upland soils [J]. Letters in Applied Microbiology, 1997, 25(1):30-33.
推薦試劑盒:MoBioPowerSoil?DNA Isolation Kit

根際土壤

· 取樣方法

取樣器具要事先消毒滅菌處理,采集20cm深的根際土壤置于50mL的無菌管里,迅速放在液氮里儲存,用20目的篩子過篩,去除植物根、動物殘骸以及其他雜質后分裝到無菌離心管里,每管3~5g,密封后立即放于-80℃儲存備用。

· 提取方法

手提方法可參考:
[1] Niemi R M, Heiskanen I, Wallenius K, et al.Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGEanalysis of bacterial consortia [J]. Journal of Microbiological Methods, 2001,45(3):155-165.
[2] Wang J, Wu G, Li W, et al. A DNA extraction method used for evaluation of diversityof the plant rhizosphere microbial community[J]. 2013.
推薦試劑盒:MoBio PowerSoil?DNA Isolation Kit 或 MoBio PowerSoil High-Throughput DNA Isolation Kit

水體

· 取樣方法

根據研究目的確定采樣深度和范圍,采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾,可以根據水樣的渾濁程度選擇相應孔徑的濾膜,之后置于-80℃保存備用。

清亮水樣:可選擇小孔徑的濾膜,一般選0.22μm 或0.45μm 的濾膜,過濾水樣體積大于10L;

渾濁水樣:過濾前靜置分離懸浮顆粒,也可以用大孔徑的濾膜預過濾一遍,再用小孔徑的濾膜進行過濾。

· 提取方法

手提DNA可參考文獻:
[1] Arumugam R, Chan X Y, Yin W F, et al. Metagenomic analysis of Microbial Diversity of Tropical Sea Water of Georgetown Coast, Malaysia [J]. Life Science Journal,2013, 10(3).
[2] Shi P,Jia S, Zhang X X, et al. Metagenomic insights into chlorination effects onmicrobial antibiotic resistance in drinking water [J]. Water Research, 2013,47(1): 111-120.
推薦試劑盒:PowerWater?Sterivex ? DNA Isolation Kit (MoBio, USA)

活性污泥及海洋沉積物

· 取樣方法

活性污泥:從曝氣池中取25mL懸浮的活性污泥樣本放入無RNA 酶的管中,迅速放入液氮并運送到實驗室提取DNA;

地表沉積物:取距地表0-10cm 的地表沉積物,每個位點取1-2kg的沉積物裝入消毒聚乙烯塑料袋中,立刻置于0℃運到實驗室進行DNA提取。

· 提取方法

推薦試劑盒:
FastDNA?Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, USA)或UltraClean?Mega Soil DNA Isolation kit(MoBio,USA)進行提取并利用PowerClean? DNA Clean-Up kit (MoBio,USA)進行純化。
注:每個樣本提取兩次并將提取好的DNA混為一管以減少DNA提取的潛在偏好性,參考Cai L, Yu K, Yang Y, et al. Metagenomic exploration reveals highlevels of microbial arsenic metabolism genes in activated sludge and coastalsediments [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2013, 97(21): 9579-9588.

植物內生菌

· 取樣方法

用流水沖洗植物根樣本表面并摘掉小側根,粘根土壤粒要進行化學消毒(95%的次氯酸鈉2min),用無菌玻璃珠在無菌水中劇烈搖晃,物理去除細菌。之后用手術刀片劃開根部組織以釋放內生菌,用無菌玻璃珠在9%的生理鹽水中振蕩,在30℃的條件下振蕩4h以分離內生菌,之后用5μm濾膜過濾,15000r,4℃離心收集沉淀并置于液氮中保存。

· 提取方法

內生真菌樣本DNA提取參考文獻:
Sessitsch A, Hardoim P, D?ring J, et al. Functional characteristics of an endophytecommunity colonizing rice roots as revealed by metagenomic analysis [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2012, 25(1): 28-36.
內生細菌樣本DNA提取方法參考文獻:
Shi Y W, Yang H, Zhang T, et al. Illumina-based analysis of endophytic bacterialdiversity and space-time dynamics in sugar beet on the north slope of Tianshanmountain [J]. Applied microbiology and biotechnology, 2014, 98(14): 6375-6385.

空氣

· 取樣方法

采樣使用的器具要每天進行更換,并且使用75%的酒精進行洗滌)

1.收集目標區域的空氣微顆粒,采用不同孔徑大小的無菌濾膜進行目的顆粒的篩選,如果不分顆粒小大,可直接選取最小孔徑的無菌濾膜進行過濾,以保證空氣微生物最大程度上被過濾下來;

2.將過濾好的無菌濾膜迅速密封,置于-80℃條件下進行保存;
3.截取適當大小的濾膜放在含有1×PBS緩沖液的50mL離心管中,于4℃條件下,用200g加速度離心3h;

4.最后溫和漩渦處理,使用0.2μm的Supor200 PES Membrane Disc Filter過濾重懸液后待提取。

· 提取方法

手提可參考文獻:
[1] Jiang W, Liang P, Wang B, et al. Optimized DNA extraction and metagenomic sequencingof airborne microbial communities.[J]. Nature Protocols, 2015, 10(5):768-79.
[2] Yooseph S, Andrews-Pfannkoch C, Tenney A, et al. A Metagenomic Framework for the Studyof Airborne Microbial Communities [J]. Plos One, 2013, 8(12): e81862;
推薦試劑盒:
MoBioPowerSoil DNA isolation kit.

物體表面

· 取樣方法

245棋牌將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當中,加入PBS緩沖液后進行振蕩,使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液當中,之后直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之后再進行DNA的提取。

· 提取方法

提取具體流程可參考文獻:
HewittK M, Gerba C P, Maxwell S L, et al. Office space bacterial abundance and diversityin three metropolitan areas [J]. 2012.